VAChT CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401240-ACT

SLC18A3 kodiert den vesikulären Acetylcholin-Transporter (VAChT), ein Membranprotein synaptischer Vesikel, das zytosolisches Acetylcholin in sekretorische Vesikel in cholinergen Neuronen und anderen cholinergen Zelltypen verpackt. Indem VAChT vesikuläres Acetylcholin für die regulierte Exozytose bereitstellt, ist es essenziell für die synaptische Übertragung an neuromuskulären Endplatten sowie im autonomen und zentralen Nervensystem und beeinflusst damit die Erregungs‑Kontraktions‑Kopplung und die Aktivität neuronaler Schaltkreise. Die VAChT-Funktion ist eng mit dem Acetylcholin-Stoffwechsel und den Vesikelzyklus‑Signalwegen verknüpft, einschließlich der Abstimmung mit der von der Cholinacetyltransferase abhängigen Synthese und der vesikulären Transportmaschinerie. Veränderte cholinerge Signalübertragung und eine dysregulierte Acetylcholinfreisetzung sind in zahlreichen neurobiologischen Kontexten relevant, wodurch SLC18A3 ein nützliches Ziel ist, um Mechanismen cholinerger Fehlfunktionen in krankheitsrelevanten Modellen zu untersuchen.

VAChT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC18A3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

VAChT Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC18A3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC18A3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen VAChT-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC18A3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von VAChT-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des VAChT-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC18A3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.