V-ATPase D1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403669-ACT

ATP6V0D1 kodiert die D1‑Untereinheit des V0‑Membransegments der V‑Typ‑Protonen‑ATPase (V‑ATPase), einem zentralen Bestandteil der rotierenden Protonenpumpe, die Endosomen, Lysosomen und andere intrazelluläre Organellen ansäuert. Durch die Ansäuerung von Organellen unterstützt die V‑ATPase‑Aktivität die rezeptorvermittelte Endozytose, die lysosomale Proteolyse, die Autophagie und den vesikulären Transport und trägt in verschiedenen Zelltypen zur pH‑Homöostase bei. Eine korrekte Assemblierung der V‑ATPase und die Protonentranslokation sind zudem wichtig für endolysosomale Signalplattformen, einschließlich Signalwege, die von der Lysosomenfunktion abhängen, wie etwa die Nährstoffsensorik von mTORC1. Eine Fehlregulation der endolysosomalen Ansäuerung und des intrazellulären Transports wird mit Neurodegeneration, veränderten Immunantworten und krebsassoziierten Invasionsphänotypen in Verbindung gebracht, was ATP6V0D1 zu einem relevanten Ziel für mechanistische Studien der Organellenfunktion macht.

V-ATPase D1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ATP6V0D1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

V-ATPase D1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ATP6V0D1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ATP6V0D1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen V-ATPase D1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ATP6V0D1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von V-ATPase D1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des V-ATPase D1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ATP6V0D1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.