V-ATPase A2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406000-ACT

ATP6V0A2 kodiert die a2-Isoform der a‑Untereinheit der V0‑Domäne der vakuolären H+-ATPase (V‑ATPase), einer aus mehreren Untereinheiten bestehenden Protonenpumpe, die Endosomen, Lysosomen und sekretorische Kompartimente ansäuert. Durch die Regulation des pH-Werts in Organellen unterstützt die V‑ATPase‑Untereinheit A2 die rezeptorvermittelte Endozytose, den vesikulären Transport, die Proteinprozessierung sowie lysosomenabhängige Abbauwege, die die zelluläre Homöostase beeinflussen. Die Aktivität von ATP6V0A2 wirkt sich zudem auf den Aufbau der extrazellulären Matrix und auf glycosylierungsassoziierte Sekretionsprozesse aus und verknüpft damit die Ansäuerung intrazellulärer Kompartimente mit der Gewebeorganisation. Störungen oder Fehlregulationen von ATP6V0A2 wurden mit angeborenen Erkrankungen in Verbindung gebracht, die die Integrität des Bindegewebes und die Glykosylierung betreffen, was das Gen für Studien zur intrazellulären pH-Kontrolle und zur Biologie sekretorischer Signalwege relevant macht.

V-ATPase A2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ATP6V0A2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

V-ATPase A2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ATP6V0A2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ATP6V0A2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen V-ATPase A2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ATP6V0A2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von V-ATPase A2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des V-ATPase A2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ATP6V0A2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.