UPII CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402242-ACT

UPK2 kodiert Uroplakin II (UPII), eine integrale Komponente der apikalen Plaques des Urothels, die zur Bildung der asymmetrischen Einheitsmembran beitragen und die Barriereeigenschaften differenzierter Umbrella-Zellen unterstützen. UPII assembliert im sekretorischen Weg gemeinsam mit anderen Uroplakinen und wird zur apikalen Zelloberfläche transportiert, wo es zur Membranorganisation, epithelialen Polarität und mechanischen Stabilität im Harntrakt beiträgt. Als linienrestriktiver Marker der urothelialen Differenzierung wird eine veränderte UPK2-Expression häufig genutzt, um Änderungen in Programmen der epithelialen Reifung und der zellulären Identität in der Blasenbiologie zu untersuchen. Dysregulierte Uroplakin-Expressionsmuster werden häufig im Kontext urothelialer Pathologien untersucht, einschließlich tumorassoziierter Differenzierungszustände und einer veränderten Barrierefunktion.

UPII Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen UPK2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

UPII Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des UPK2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der UPK2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen UPII-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native UPK2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von UPII-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des UPII-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem UPK2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.