UNC5H2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402347-ACT

UNC5B codifica il recettore della netrina UNC5H2, un recettore transmembrana per segnali di guida che regola la navigazione degli assoni, la migrazione neuronale e la sopravvivenza cellulare tramite segnalazione dipendente dalla netrina e un comportamento da “recettore di dipendenza” in assenza di ligando. UNC5H2 modula la dinamica del citoscheletro e l’adesione attraverso le GTPasi della famiglia Rho e vie associate alle adesioni focali, influenzando la motilità direzionale e l’organizzazione dei tessuti durante lo sviluppo. In contesti non neuronali, UNC5B/UNC5H2 contribuisce all’organizzazione vascolare ed epiteliale e può influenzare programmi di apoptosi, proliferazione e invasione. Una deregolazione della segnalazione di UNC5B è stata associata ad alterazioni della migrazione e della sopravvivenza cellulare, rilevanti per i disturbi del neurosviluppo e per la biologia del cancro, rendendolo un bersaglio utile per studi meccanicistici delle vie di segnalazione.

UNC5H2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di UNC5B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

UNC5H2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus UNC5B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione UNC5B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di UNC5H2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus UNC5B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da UNC5H2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via UNC5H2 nelle cellule tumorali con espressione di UNC5B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.