Plasmide CRISPR d'Activation (h) ULK3: sc-403581-ACT

ULK3 code une protéine kinase sérine/thréonine de la famille des kinases de type unc-51, qui coordonne des événements de signalisation liés aux réponses cellulaires au stress et à des programmes transcriptionnels régulés par des morphogènes. ULK3 a été impliquée dans la modulation de l’activité Hedgehog/GLI et dans des interactions (cross-talk) avec des voies contrôlant l’autophagie, la dynamique du cytosquelette et la progression du cycle cellulaire, soutenant une régulation dépendante du contexte de la prolifération et de la différenciation. Par ces connexions en réseau, ULK3 est étudiée dans des modèles de régulation du développement et de dérégulation de voies de signalisation pertinentes pour la biologie du cancer et les phénotypes fibrosants. Une expression ou une signalisation de ULK3 altérée peut donc servir d’indicateur mécanistique du remaniement des voies dans des états cellulaires pertinents pour la maladie.

ULK3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ULK3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

ULK3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ULK3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ULK3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de ULK3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ULK3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de ULK3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie ULK3 dans les cellules tumorales présentant une expression de ULK3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.