ULK1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400516-ACT

ULK1 (UNC-51-like Autophagie-aktivierende Kinase 1) ist eine Serin/Threonin-Kinase, die die Makroautophagie einleitet, indem sie Nährstoff- und Energiesignale integriert. Als zentraler Bestandteil des ULK1-Komplexes fördert sie die Bildung des Phagophors und koordiniert als Reaktion auf eine Hemmung von mTORC1 sowie eine Aktivierung von AMPK die nachgeschaltete Autophagie-Maschinerie. Durch die Regulation des autophagischen Flusses beeinflusst ULK1 die mitochondriale Homöostase, die Proteostase und die zelluläre Anpassung an metabolischen Stress. Eine fehlregulierte ULK1-Signalgebung und Autophagiekontrolle werden u. a. mit Neurodegeneration, Infektionsbiologie und Stressantworten von Krebszellen in Verbindung gebracht, wobei eine veränderte katabole Kapazität Überlebenswege neu gestalten kann.

ULK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ULK1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ULK1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ULK1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ULK1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ULK1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ULK1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ULK1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ULK1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ULK1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.