UFD1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403304-ACT

UFD1L kodiert UFD1, eine zentrale Komponente des UFD1–NPL4–VCP/p97‑Komplexes, der die Ubiquitinerkennung mit der ATP‑abhängigen Extraktion von Proteinen aus Membranen und makromolekularen Assemblies zur proteasomalen Degradation koppelt. Diese Achse unterstützt die endoplasmatische‑Retikulum‑assoziierte Degradation (ERAD), die ribosomenassoziierte Qualitätskontrolle sowie die Auflösung festgefahrener Proteinkomplexe und erhält damit die Proteostase unter Stress. Über diese Prozesse beeinflusst UFD1 den Verlauf des Zellzyklus, die Genomstabilität und Reaktionen auf Stress durch fehlgefaltete Proteine. Eine Dysregulation UFD1L‑gekoppelter Qualitätskontrollwege wurde mit veränderter Stresstoleranz und Phänotypen in Zusammenhang gebracht, wie sie bei Erkrankungen mit gestörter Proteostase und chromosomalen Anomalien beobachtet werden, was seinen Nutzen für mechanistische Krankheitsmodelle unterstreicht.

UFD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen UFD1L-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

UFD1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des UFD1L-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der UFD1L-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen UFD1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native UFD1L-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von UFD1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des UFD1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem UFD1L-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.