Plasmide CRISPR d'Activation (h) UBC2: sc-404360-ACT

Le gène humain **UBE2A** code l’enzyme E2 de conjugaison de l’ubiquitine **UBC2**, un composant central du système ubiquitine–protéasome qui transfère l’ubiquitine activée des enzymes E1 vers les ligases E3 afin de favoriser l’ubiquitination des substrats. Par cette activité, UBC2 contribue à réguler le contrôle qualité des protéines, la progression du cycle cellulaire et les réponses aux dommages de l’ADN en modulant les voies de signalisation de l’ubiquitine et les réseaux de protéostasie. La fonction d’UBE2A/UBC2 est liée à des voies contrôlant le renouvellement de protéines régulatrices et l’adaptation au stress, ce qui la rend pertinente pour l’étude du développement neuronal, du maintien du génome et de l’homéostasie cellulaire. Des altérations de la dynamique d’ubiquitination impliquant UBE2A ont été associées à des phénotypes neurodéveloppementaux et à une protéostasie dérégulée dans des contextes pertinents pour la maladie.

UBC2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de UBE2A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

UBC2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus UBE2A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription UBE2A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de UBC2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus UBE2A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de UBC2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie UBC2 dans les cellules tumorales présentant une expression de UBE2A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.