Plasmide CRISPR d'Activation (h) Type I 4-phosphatase: sc-404750-ACT

INPP4A code la 4‑phosphatase de type I, une phosphatase lipidique qui hydrolyse le phosphatidylinositol 3,4‑bisphosphate en phosphatidylinositol 3‑phosphate, contribuant ainsi à façonner les pools de phosphoinositides qui régulent le trafic membranaire et la transduction du signal. En modulant le recrutement, dépendant du PtdIns(3,4)P2, de protéines à domaine d’homologie à la pleckstrine (PH), INPP4A influence la dynamique de la signalisation PI3K/AKT, le trafic endocytique et les cascades de phosphorylation en aval qui affectent les programmes de croissance et de survie cellulaires. Des altérations de l’expression ou de l’activité d’INPP4A ont été associées à une dérégulation de la signalisation des phosphoinositides observée dans plusieurs contextes liés à des maladies, notamment la biologie tumorale et des phénotypes neurologiques, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques du remodelage des voies de signalisation.

Type I 4-phosphatase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de INPP4A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Type I 4-phosphatase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus INPP4A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription INPP4A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Type I 4-phosphatase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus INPP4A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Type I 4-phosphatase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Type I 4-phosphatase dans les cellules tumorales présentant une expression de INPP4A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.