Plasmide CRISPR d'Activation (h) TTC35: sc-405724-ACT

EMC2 code pour TTC35, un composant conservé du complexe des protéines membranaires du réticulum endoplasmique (EMC) contenant des répétitions tétratricopeptidiques. Ce complexe favorise l’insertion et la maturation des protéines membranaires multipasse, contribuant ainsi à la protéostasie du RE, au trafic membranaire et aux réponses cellulaires au stress. La perturbation des sous-unités de l’EMC peut altérer la biogenèse de récepteurs, de canaux et de transporteurs, reliant les processus régulés par EMC2/TTC35 à un dysfonctionnement de la voie sécrétoire et à une sensibilité accrue au stress du RE. En conséquence, EMC2 est fréquemment étudié dans le contexte des réseaux de contrôle qualité des protéines et de phénotypes pertinents pour les maladies, induits par des défauts de repliement ou de trafic des protéines membranaires.

TTC35 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EMC2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

TTC35 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EMC2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EMC2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de TTC35. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EMC2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de TTC35 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie TTC35 dans les cellules tumorales présentant une expression de EMC2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.