Triadin CRISPR Activation Plasmid (m): sc-429407-ACT

Das murine Trdn-Gen kodiert Triadin, ein Membranprotein des junctionalen sarkoplasmatischen Retikulums, das in quergestreifter Muskulatur die Erregungs‑Kontraktions‑Kopplung organisiert, indem es den Ryanodinrezeptor (RyR), Calsequestrin und weitere luminale Partner als Gerüstprotein zusammenführt. Über diesen Calciumfreisetzungskomplex trägt Triadin zur Regulation der Ca²⁺-Speicherung im SR und der Freisetzungskinetik bei, indem es Membrandepolarisation mit Ca²⁺-abhängiger Kontraktion und nachgeschalteten calciumresponsiven Signalprogrammen verknüpft. Eine veränderte TRDN-Funktion stört die Ca²⁺-Homöostase, destabilisiert das Kanalverhalten des Ryanodinrezeptors und ist mit Muskel- und kardialen Phänotypen verbunden, die mit arrhythmogenen und myopathischen Mechanismen in Zusammenhang stehen. Trdn wird daher häufig in Signalwegen untersucht, die die Architektur der SR-Junktion, das Calcium-Handling und die Zuverlässigkeit der Erregungs‑Kontraktions‑Kopplung in Kardiomyozyten und Skelettmuskelfasern steuern.

Triadin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Trdn-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Triadin Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Trdn-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Trdn-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Triadin-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Trdn-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Triadin-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Triadin-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Trdn-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.