Transketolase CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401941-ACT

Das humane TKT-Gen kodiert die Transketolase, ein thiaminpyrophosphat‑abhängiges Enzym, das reversible Zwei‑Kohlenstoff‑Transferreaktionen im nichtoxidativen Zweig des Pentosephosphatwegs katalysiert. Durch die gegenseitige Umwandlung von Ribose‑5‑phosphat und glykolytischen Zwischenprodukten trägt die Transketolase zur Koordination der Nukleotidbiosynthese, der Redoxhomöostase über die Kopplung an NADPH‑bildende Reaktionen sowie des gesamten Kohlenstoffflusses während Proliferation und metabolischem Stress bei. Die TKT‑Aktivität beeinflusst zelluläre Antworten auf oxidativen Stress und die Nährstoffverfügbarkeit, und eine veränderte Regulation des Pentosephosphatwegs wurde mit metabolischer Umprogrammierung in unterschiedlichen Krankheitskontexten in Verbindung gebracht, darunter Krebsbiologie und angeborene Stoffwechselstörungen. Als zentraler Knotenpunkt zwischen Glykolyse und Pentosemetabolismus wird TKT häufig in pathway‑basierten Analysen des biosynthetischen Bedarfs, der antioxidativen Kapazität und von Zellzustandsübergängen untersucht.

Transketolase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TKT-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Transketolase Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TKT-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TKT-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Transketolase-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TKT-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Transketolase-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Transketolase-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TKT-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.