TPPP3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405113-ACT

TPPP3 (Tubulin-Polymerisations-förderndes Protein, Familienmitglied 3) ist ein mikrotubuli-assoziiertes Protein, das an der Organisation und Dynamik des Zytoskeletts beteiligt ist und Prozesse wie Zellform, intrazellulären Transport und Zellzyklusprogression beeinflusst. Durch die Modulation der Tubulinpolymerisation und der Mikrotubuli-Stabilität kann TPPP3 Signalwege beeinflussen, die mit epithelialer Differenzierung, Motilität und Stressantworten verknüpft sind. Eine veränderte TPPP3-Expression wurde in mehreren Krankheitskontexten beschrieben, darunter Karzinome, bei denen Änderungen der zytoskelettalen Regulation mit Invasions- und Proliferationsphänotypen korrelieren. Diese Eigenschaften machen TPPP3 zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien der mikrotubuli-abhängigen Signalübertragung und phänotypischen Plastizität in menschlichen Zellen.

TPPP3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TPPP3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TPPP3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TPPP3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TPPP3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TPPP3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TPPP3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TPPP3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TPPP3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TPPP3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.