Plásmido CRISPR de Activación (h) TMEM5: sc-411455-ACT

TMEM5 codifica una proteína transmembrana implicada en la glicosilación de la α-distroglucana, una modificación necesaria para la unión adecuada a la matriz extracelular y la integridad de la membrana. A través de su papel en la vía de glicosilación de la distroglucana, TMEM5 contribuye a la adhesión celular y a la arquitectura tisular, en particular en los sistemas neuromusculares. La alteración de la función de TMEM5 se ha relacionado con las distroglicanopatías, una clase de trastornos caracterizados por una glicosilación defectuosa de la α-distroglucana y por patología del desarrollo y muscular asociada. En consecuencia, TMEM5 es de interés para estudios mecanísticos de la biología de receptores dependientes de glicanos y de redes de glicosilación asociadas a membrana.

TMEM5 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de TMEM5 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

TMEM5 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus TMEM5 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional TMEM5, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de TMEM5. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo TMEM5 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de TMEM5 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía TMEM5 en células tumorales con expresión de TMEM5 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.