TIA-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400212-ACT

TIA1 kodiert TIA-1, ein RNA-bindendes Protein, das U-reiche Sequenzen erkennt und die posttranskriptionelle Genregulation über alternatives Spleißen, mRNA-Stabilisierung und Translationsrepression koordiniert. TIA-1 ist ein zentraler Bestandteil von Stressgranula und verknüpft zelluläre Stressantworten mit Veränderungen im Schicksal von Transkripten, wodurch es Prozesse wie Apoptose, angeborene Immun-Signalgebung und die Expression entzündungsassoziierter Gene beeinflusst. Aufgrund seiner Funktionen im RNA-Stoffwechsel und in stressadaptiven Programmen wurde eine veränderte TIA-1-Aktivität mit fehlregulierten Zytokinwegen und abweichender RNA-Prozessierung in Forschungszusammenhängen zu Krebs und Neurodegeneration in Verbindung gebracht. Diese Funktionen machen TIA1 zu einem nützlichen Knotenpunkt, um zu untersuchen, wie Stress-Signalgebung Genexpressionsnetzwerke auf RNA-Ebene umgestaltet.

TIA-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TIA1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TIA-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TIA1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TIA1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TIA-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TIA1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TIA-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TIA-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TIA1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.