TFEB CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401388-ACT

Der humane TFEB (Transkriptionsfaktor EB) ist ein Masterregulator der lysosomalen Biogenese und der Autophagie und koordiniert die Expression von Genen des CLEAR-Netzwerks, die die endolysosomale Funktion, den Membrantransport und die zelluläre Clearance steuern. Die TFEB-Aktivität ist eng mit der Nährstoffsensorik verknüpft, insbesondere über mTORC1-abhängige Phosphorylierung und nukleäre Translokation, wodurch Signale metabolischen Stresses mit katabolen Programmen integriert werden. Eine fehlregulierte TFEB-Signalgebung wird mit beeinträchtigter Proteostase und lysosomenbezogenen Funktionsstörungen in Verbindung gebracht, wie sie bei Neurodegeneration, lysosomalen Speicherkrankheiten und in der Krebsbiologie beobachtet werden. Als transkriptioneller Knotenpunkt bietet TFEB einen gut zugänglichen Ansatzpunkt, um autophagischen Flux, lysosomales Remodeling und stressadaptive transkriptionelle Netzwerke zu untersuchen.

TFEB Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TFEB-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TFEB Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TFEB-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TFEB-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TFEB-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TFEB-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TFEB-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TFEB-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TFEB-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.