TET3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-414997-ACT

Das humane TET3 kodiert eine Fe(II)/2‑Oxoglutarat‑abhängige Dioxygenase, die die schrittweise Oxidation von 5‑Methylcytosin zu 5‑Hydroxymethylcytosin und nachgeschalteten oxidierten Basen katalysiert und damit aktive und passive DNA‑Demethylierung unterstützt. Über diese epigenetische Editieraktivität reguliert TET3 Transkriptionsprogramme, die an Chromatin‑Remodeling, Linienspezifikation und zellulären Stressantworten beteiligt sind. Die TET3‑Funktion überschneidet sich mit DNA‑Reparatur‑gekoppelten Demethylierungsprozessen und allgemeineren Signalwegen zur Aufrechterhaltung des Chromatinzustands, die die Zellidentität prägen. Eine fehlregulierte TET3‑Aktivität und veränderte 5hmC‑Muster wurden mit entwicklungsbedingten und neurologischen Phänotypen in Verbindung gebracht und werden häufig im Kontext epigenetischer Instabilität in der Krebsbiologie untersucht.

TET3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TET3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TET3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TET3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TET3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TET3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TET3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TET3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TET3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TET3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.