TCP-1 γ CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403203-ACT

CCT3 kodiert die humane TCP-1-Gamma-Untereinheit des zytosolischen Chaperonin-Komplexes CCT/TRiC (chaperonin-containing TCP1), einer essenziellen ATP-abhängigen Faltungsmaschine für viele neu synthetisierte Proteine. CCT/TRiC unterstützt die Proteostase, indem es die korrekte Faltung von Zytoskelettproteinen wie Aktin und Tubulin fördert, und es beeinflusst die Reifung verschiedener Signalregulatoren, die Zellwachstum und Stressantworten steuern. Über diese Funktionen trägt TCP-1 Gamma zu Signalwegen bei, die die Organisation des Zytoskeletts, den Fortschritt des Zellzyklus und die Proteinkontrolle (Protein-Quality-Control) regulieren. Eine fehlregulierte Chaperonin-Aktivität wurde mit einer veränderten Stabilität des Proteoms in proliferativen und neurodegenerativen Kontexten in Verbindung gebracht, was CCT3 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien faltungsabhängiger Phänotypen macht.

TCP-1 γ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CCT3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TCP-1 γ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CCT3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CCT3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TCP-1 γ-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CCT3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TCP-1 γ-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TCP-1 γ-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CCT3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.