TBCK CRISPR Activation Plasmid (h): sc-409581-ACT

TBCK (TBC1 domain containing kinase) kodiert einen zytosolischen, multidomänigen Regulator, der mit Membrantransport und Wachstumssteuerung in Verbindung gebracht wird; es wurden Funktionen in Rab-GTPase-assoziierten Prozessen sowie in Signalnetzwerken beschrieben, die die zelluläre Homöostase beeinflussen. Beim Menschen wird TBCK mit der Modulation mTOR-assoziierter Signalwege und der Autophagie‑/Lysosomenfunktion verknüpft und damit mit Mechanismen, die Zellgröße, Stoffwechsel und Stressantworten regulieren. Eine veränderte TBCK-Aktivität wurde mit neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen und syndromalen Erkrankungen assoziiert, was seine Relevanz für die Untersuchung neuronaler Erhaltung, Proteostase und gestörter Signalregulation unterstreicht. Diese Eigenschaften machen TBCK zu einem nützlichen Ziel für mechanistische Studien zum intrazellulären Transport und zum Crosstalk zwischen Signalwegen.

TBCK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TBCK-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TBCK Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TBCK-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TBCK-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TBCK-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TBCK-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TBCK-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TBCK-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TBCK-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.