TAZ CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400320-ACT

WWTR1 kodiert den transkriptionellen Koaktivator TAZ (TAFAZ), einen zentralen Effektor des Hippo-Signalwegs, der Zell-Zell-Kontakt, mechanische Reize und Polarität mit Transkriptionsprogrammen koppelt, die Proliferation, Differenzierung und Gewebewachstum steuern. Wenn die Hippo-Kinasen inaktiv sind, reichert sich TAZ im Zellkern an und kooperiert mit Transkriptionsfaktoren der TEAD-Familie, um Gene zu regulieren, die an der Umgestaltung der extrazellulären Matrix, der epithelial-mesenchymalen Plastizität und stammzellähnlichen Zellzuständen beteiligt sind. Eine fehlregulierte WWTR1/TAZ-Aktivität wird mit gestörter Mechanotransduktion und veränderter Linienspezifikation in verschiedenen Krankheitskontexten in Verbindung gebracht, darunter krebsassoziierte Transkriptionsprogramme und fibrotischer Umbau. Diese Eigenschaften machen TAZ zu einem häufig genutzten Knotenpunkt, um YAP/TAZ–TEAD-Outputs, das Crosstalk mit der Wnt- und TGF-β-Signalgebung sowie kontextabhängige transkriptionelle Kontrolle zu untersuchen.

TAZ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen WWTR1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

TAZ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des WWTR1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der WWTR1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen TAZ-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native WWTR1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von TAZ-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des TAZ-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem WWTR1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.