Tak1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-424044-ACT

Mouse Map3k7 kodiert TAK1, eine Serin/Threonin-MAP3K, die Signale downstream von Rezeptoren für TNF, IL‑1, TLR-Liganden und Mitglieder der TGF‑β-Familie integriert, um Entzündungs- und Stressantworten zu koordinieren. TAK1 phosphoryliert MAP2Ks, um die JNK- und p38‑MAPK-Kaskaden zu aktivieren, und aktiviert den IKK-Komplex, um die NF‑κB‑abhängige Transkription anzustoßen; dadurch werden Zytokinproduktion, Apoptose und Entscheidungen über das Zellüberleben mitgeprägt. Über diese Signalwege beeinflusst TAK1 die Aktivierung der angeborenen Immunität, die Gewebehomöostase sowie zelluläre Reaktionen auf genotoxischen und oxidativen Stress. Eine fehlregulierte TAK1-Signalübertragung wurde mit entzündlichen Pathologien, fibroseassozierten Prozessen und onkogenen Signalnetzwerken in Verbindung gebracht, weshalb Map3k7 häufig als zentraler Knotenpunkt für mechanistische Studien zur Signalweg‑Kreuzregulation genutzt wird.

Tak1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Map3k7-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Tak1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Map3k7-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Map3k7-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Tak1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Map3k7-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Tak1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Tak1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Map3k7-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.