Tak1 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-424044-ACT

Mouse Map3k7 codifica TAK1, una MAP3K serina/treonina che integra i segnali a valle dei recettori per TNF, IL-1, ligandi dei TLR e membri della famiglia TGF-β, coordinando le risposte infiammatorie e allo stress. TAK1 fosforila le MAP2K attivando le cascate JNK e p38 MAPK e attiva il complesso IKK per indurre la trascrizione dipendente da NF-κB, modulando così la produzione di citochine, l’apoptosi e le decisioni di sopravvivenza cellulare. Attraverso queste vie, TAK1 influenza l’attivazione dell’immunità innata, l’omeostasi tissutale e le risposte cellulari allo stress genotossico e ossidativo. Una segnalazione di TAK1 deregolata è stata implicata in patologie infiammatorie, processi legati alla fibrosi e reti di segnalazione oncogeniche, rendendo Map3k7 un nodo ampiamente utilizzato per studi meccanicistici sul cross-talk tra vie di segnalazione.

Tak1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Map3k7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Tak1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Map3k7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Map3k7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Tak1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Map3k7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Tak1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Tak1 nelle cellule tumorali con espressione di Map3k7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.