T1R3 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401808-ACT

TAS1R3 kodiert den menschlichen Geschmacksrezeptor Typ 1, Mitglied 3 (T1R3), einen GPCR der Klasse C, der zur Vermittlung der Wahrnehmung von „süß“ bzw. „umami“ Heterodimere mit TAS1R2 bzw. TAS1R1 bildet. Über die Gustation hinaus wird T1R3 in zahlreichen extraoralen Geweben exprimiert, wo er an Nährstoff-Sensing-Programmen beteiligt ist, die extrazelluläre Liganden mit intrazellulärer Signalübertragung koppeln, einschließlich G‑Protein-abhängiger Second-Messenger-Signalwege und Kalziumflüsse. Diese Signalereignisse können den zellulären Stoffwechsel, sekretorische Antworten und Transkriptionsprogramme beeinflussen, die mit der Energiehomöostase verknüpft sind. Eine dysregulierte TAS1R3/T1R3-Aktivität und -Expression wurde u. a. im Zusammenhang mit metabolischen Phänotypen und tumorgebundener Nährstoffsignalgebung untersucht, was seine Eignung als mechanistisches Ziel in pathway-orientierten Studien unterstreicht.

T1R3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TAS1R3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

T1R3 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TAS1R3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TAS1R3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen T1R3-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TAS1R3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von T1R3-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des T1R3-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TAS1R3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.