Tβ-4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-417057-ACT

Thymosin beta-4, kodiert durch das humane TMSB4X, ist ein hochkonserviertes, aktin-sequestrierendes Peptid, das die Verfügbarkeit von G‑Aktin reguliert und den Umbau des Zytoskeletts, die Zellmotilität sowie stressabhängige Veränderungen der Zellform unterstützt. Durch die Modulation der Aktindynamik beeinflusst es Prozesse wie Migration, Adhäsion und wundassoziierte zelluläre Reaktionen und wurde mit Signalwegen in Verbindung gebracht, die Entzündung und Gewebeumbau steuern. Eine veränderte TMSB4X-Expression wurde in unterschiedlichen Kontexten berichtet, darunter Tumorprogression, angiogene Signalgebung sowie fibrotische oder entzündliche Zustände, was es zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien zytoskelettabhängiger Phänotypen macht. Als breit exprimierter Regulator des Zytoskeletts stellt TMSB4X ein gut zugängliches Ziel dar, um zu untersuchen, wie die Aktin-Homöostase mit Transkriptionsprogrammen und Signalen aus der zellulären Mikroumgebung zusammenwirkt.

Tβ-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TMSB4X-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Tβ-4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TMSB4X-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TMSB4X-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Tβ-4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TMSB4X-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Tβ-4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Tβ-4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TMSB4X-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.