Plasmide CRISPR d'Activation (h) SPTLC3: sc-407807-ACT

SPTLC3 code pour une sous-unité catalytique de la sérine palmitoyltransférase, l’enzyme limitante qui initie la biosynthèse de novo des sphingolipides en condensant la sérine avec le palmitoyl-CoA. En régulant les niveaux de bases sphingoïdes, de céramides et de sphingolipides complexes en aval, SPTLC3 influence la composition membranaire, l’organisation des radeaux lipidiques et des processus de signalisation liés à l’apoptose, à l’inflammation et à l’adaptation métabolique. L’activité de SPTLC3 s’inscrit à l’interface de l’homéostasie lipidique du réticulum endoplasmique et de voies plus larges reliant le métabolisme des céramides aux réponses cellulaires au stress. Des profils de sphingolipides altérés et une expression dérégulée de SPTLC3 ont été associés à des traits cardiométaboliques et à des phénotypes inflammatoires, ce qui en fait un nœud pertinent pour des études mécanistiques de la signalisation induite par les lipides.

SPTLC3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SPTLC3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SPTLC3 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SPTLC3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SPTLC3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SPTLC3. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SPTLC3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SPTLC3 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SPTLC3 dans les cellules tumorales présentant une expression de SPTLC3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.