Plasmide CRISPR d'Activation (h) SPTLC1: sc-402829-ACT

SPTLC1 code pour une sous-unité catalytique de la sérine palmitoyltransférase, l’enzyme limitante de la biosynthèse de novo des sphingolipides, qui condense la sérine avec le palmitoyl-CoA pour générer la 3‑céto-sphinganine. En contrôlant la production de céramide, de sphingomyéline et de glycosphingolipides complexes, SPTLC1 influence la composition membranaire, la signalisation des radeaux lipidiques, l’autophagie et les voies de réponse au stress, notamment l’homéostasie du réticulum endoplasmique (RE). Une activité altérée de SPTLC1 perturbe les profils de sphingolipides et a été associée à des phénotypes de neurodégénérescence et de neuropathie périphérique, ainsi qu’à une dérégulation métabolique plus large. En tant que nœud central du métabolisme lipidique, SPTLC1 est largement étudié pour son impact sur la signalisation cellulaire, la fonction des organites et les processus inflammatoires induits par les lipides.

SPTLC1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SPTLC1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SPTLC1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SPTLC1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SPTLC1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SPTLC1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SPTLC1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SPTLC1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SPTLC1 dans les cellules tumorales présentant une expression de SPTLC1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.