Plasmide CRISPR d'Activation (h) SPOP: sc-401290-ACT

Le gène humain **SPOP** code la protéine POZ de type « speckle », un adaptateur des complexes d’ubiquitine‑ligase E3 dépendants de **CUL3** qui reconnaît les protéines substrats via son domaine **MATH** et facilite leur ubiquitination ainsi que leur dégradation par le protéasome. En régulant la stabilité de régulateurs clés de la signalisation et de la transcription, SPOP influence l’homéostasie des protéines nucléaires, les réponses aux dommages de l’ADN et des programmes associés au cycle cellulaire. Des altérations de la fonction ou de l’expression de SPOP ont été associées à une dérégulation de la protéostasie et du contrôle transcriptionnel dans de multiples contextes pathologiques, ce qui en fait un nœud mécanistique pertinent pour l’étude des réseaux de signalisation dépendants de l’ubiquitine. Ces caractéristiques font de SPOP une cible utile pour sonder le remodelage des voies induit par des changements dans la sélection des substrats par l’ubiquitine‑ligase et leur renouvellement.

SPOP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SPOP sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SPOP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SPOP dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SPOP, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SPOP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SPOP natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SPOP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SPOP dans les cellules tumorales présentant une expression de SPOP silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.