Plásmido CRISPR de Activación (m) SphK1: sc-423102-ACT

Sphk1 codifica la esfingosina quinasa 1 (SphK1), una quinasa lipídica citosólica que fosforila la esfingosina para generar esfingosina-1-fosfato (S1P), un potente mediador lipídico bioactivo. Al desplazar el equilibrio ceramida/esfingosina/S1P, SphK1 influye en la supervivencia, proliferación y migración celular, así como en las respuestas al estrés, y se integra con el metabolismo de los esfingolípidos, la señalización de S1P impulsada por GPCR y las cascadas inflamatorias. La actividad de SphK1 se ha vinculado a la regulación del tráfico vascular y de células inmunitarias, programas angiogénicos y la producción de citocinas a través de vías que incluyen MAPK/ERK, PI3K/AKT y la señalización de NF-κB. La señalización desregulada de SphK1/S1P se estudia con frecuencia en contextos como la inflamación, la fibrosis, la disfunción metabólica y fenotipos asociados al cáncer en modelos murinos.

SphK1 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Sphk1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

SphK1 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Sphk1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Sphk1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de SphK1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Sphk1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de SphK1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía SphK1 en células tumorales con expresión de Sphk1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.