SPAG17 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-410482-ACT

SPAG17 (spermienassoziiertes Antigen 17) kodiert ein mikrotubuliassoziiertes Gerüstprotein, das für eine korrekte axonemale Architektur und die Funktion motiler Zilien erforderlich ist. Es trägt zur Assemblierung und Stabilität des Zentralpaar-Komplexes sowie zu Interaktionen mit radialen Speichen bei, die das dyneinvermittelte Schlagen koordinieren, und verknüpft SPAG17 damit mit Signalwegen der Zytoskelettorganisation und Ziliogenese. In der Humanbiologie sind veränderte SPAG17-Expression oder -Funktion mit Defekten der Zilienmotilität assoziiert, die die Reproduktionsbiologie und andere zilienabhängige Gewebe beeinträchtigen können. Als Regulationsfaktor von Zilien/Flagellen ist SPAG17 ein nützliches Markergen zur Untersuchung transkriptioneller Programme, die Motilität, Differenzierung und Mikrotubulidynamik steuern.

SPAG17 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SPAG17-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SPAG17 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SPAG17-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SPAG17-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SPAG17-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SPAG17-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SPAG17-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SPAG17-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SPAG17-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.