Sp8 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401546-ACT

SP8 kodiert einen Sp8-Zinkfinger-Transkriptionsfaktor, der an GC-reiche regulatorische Elemente bindet, um Genexpressionsprogramme während der menschlichen Embryonalentwicklung zu steuern. Er ist an Musterbildungs- und Differenzierungsprozessen beteiligt, einschließlich der Neuroektoderm- und kraniofazialen Entwicklung, indem er Transkriptionsnetzwerke koordiniert, die mit morphogengesteuerten Signalwegen wie WNT/β-Catenin und verwandten Entwicklungswegen verknüpft sind. Eine veränderte SP8-Aktivität oder eine Fehlregulation von Zielgen-Netzwerken wurde mit kongenitalen Fehlbildungsphänotypen und aberranter entwicklungsbezogener Genregulation in Verbindung gebracht, was SP8 für Studien zur Linienspezifizierung und Morphogenese relevant macht. Als nukleärer, DNA-bindender Regulator wird Sp8 häufig als Knotenpunkt genutzt, um Transkriptionsschaltkreise sowie die Enhancer-Promotor-Kontrolle in differenzierenden Systemen zu kartieren.

Sp8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SP8-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Sp8 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SP8-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SP8-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Sp8-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SP8-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Sp8-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Sp8-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SP8-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.