Plasmide CRISPR d'Activation (h) SNARK: sc-405079-ACT

Le gène humain **NUAK2** code **SNARK** (NUAK family SNF1-like kinase 2), une kinase sérine/thréonine apparentée à l’AMPK qui intègre l’état énergétique cellulaire aux processus de remodelage du cytosquelette, d’adhérence et de signalisation adaptative au stress. L’activité de SNARK a été associée à la régulation de la migration et de l’invasion cellulaires, à des programmes liés à la transition épithélio-mésenchymateuse, ainsi qu’à un contrôle dépendant du contexte de la survie en situation de stress métabolique, en interaction avec des voies en aval de **LKB1** et avec des modulateurs des signalisations **AKT/mTOR** et **TGF-β**. Des altérations de l’expression ou de la signalisation de NUAK2/SNARK ont été rapportées dans de multiples contextes tumoraux, ainsi que dans des états fibrosants et inflammatoires, ce qui concorde avec des rôles dans le remodelage tissulaire et les réponses au stress. Ces caractéristiques font de NUAK2 un nœud pertinent pour étudier, dans des modèles cellulaires humains, la régulation de la motilité, du métabolisme et de l’adaptation transcriptionnelle pilotée par des kinases.

SNARK Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de NUAK2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SNARK Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus NUAK2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription NUAK2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SNARK. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus NUAK2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SNARK au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SNARK dans les cellules tumorales présentant une expression de NUAK2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.