SMU1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404541-ACT

SMU1 (Suppressor von mec-8 und Homolog 1 von unc-52) kodiert einen konservierten prä-mRNA-Spleißfaktor, der mit dem Spleißosom assoziiert ist und die präzise Entfernung von Introns sowie die korrekte Definition von Exons unterstützt. Über seine Interaktionen mit weiteren Spleißregulatoren trägt SMU1 zur Integrität des Transkriptoms, zu Entscheidungen der alternativen Spleißung und zur nachgeschalteten Kontrolle der Zellzyklusprogression sowie stressantwortlicher Genexpressionsprogramme bei. Eine Störung der SMU1-abhängigen Spleißung kann das Isoformen-Gleichgewicht verschieben und die Expression von Genen verändern, die an der Genomstabilität und Proliferation beteiligt sind. Entsprechend ist eine fehlregulierte, SMU1 betreffende Spleißosomenaktivität von Interesse für Studien zu RNA-Prozessierungsdefekten, die mit krebsassoziierten Spleißsignaturen und anderen Erkrankungen in Verbindung stehen, die durch aberrante mRNA-Reifung getrieben werden.

SMU1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SMU1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SMU1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SMU1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SMU1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SMU1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SMU1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SMU1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SMU1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SMU1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.