SMRTe CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401150-ACT

NCOR2 kodiert SMRTe (silencing mediator for retinoid and thyroid hormone receptors), einen Korepressor, der als Gerüst für transkriptionelle Repressionskomplexe dient, die HDAC3 und verwandte chromatinmodifizierende Faktoren enthalten. Durch die Interaktion mit nukleären Rezeptoren und weiteren Transkriptionsfaktoren trägt SMRTe dazu bei, Chromatinkondensation und kontextabhängige Genstilllegung über hormonresponsive und entwicklungsbezogene Genprogramme hinweg zu koordinieren. Diese Regulation überschneidet sich mit Signalwegen, die Zellschicksalsentscheidungen, metabolische Homöostase und inflammatorische Signalgebung steuern, indem sie breit auf die Acetylierung von Enhancern und Promotoren wirkt. Eine fehlregulierte NCOR2/SMRTe-Aktivität wurde mit veränderten Transkriptionsnetzwerken in der Krebsbiologie, mit endokrinologisch geprägten Phänotypen sowie mit immunvermittelten Krankheitsmechanismen in Verbindung gebracht, was seine Nutzung als mechanistischer Knotenpunkt in Studien zur Genregulation unterstützt.

SMRTe Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NCOR2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SMRTe Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NCOR2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NCOR2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SMRTe-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NCOR2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SMRTe-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SMRTe-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NCOR2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.