Smad5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400443-ACT

SMAD5 kodiert Smad5, ein rezeptorreguliertes SMAD-Protein, das BMP-Signale stromabwärts von Serin/Threonin-Kinaserezeptoren vom Typ I/II weiterleitet. Nach der Phosphorylierung bildet Smad5 Komplexe mit SMAD4, akkumuliert im Zellkern und reguliert dort Transkriptionsprogramme, die die embryonale Musterbildung, die osteogene und vaskuläre Differenzierung sowie die Gewebehomöostase steuern. Die durch SMAD5 vermittelte BMP/SMAD-Signalgebung ist mit Entwicklungs- und Differenzierungsnetzwerken verknüpft und kann – abhängig vom zellulären Kontext – die Expression von Genen des Zellzyklus und der Festlegung von Zelllinien modulieren. Eine Fehlregulation der BMP–SMAD-Signalgebung, einschließlich veränderter SMAD5-Aktivität, wird mit angeborenen Fehlbildungen in Verbindung gebracht und im Zusammenhang mit krankheitsassoziierten Veränderungen der Differenzierung, fibrosebezogenen Transkriptionszuständen sowie der Tumorbiologie untersucht.

Smad5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SMAD5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Smad5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SMAD5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SMAD5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Smad5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SMAD5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Smad5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Smad5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SMAD5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.