Plasmide CRISPR d'Activation (h) SIRT5: sc-416994-ACT

La protéine humaine SIRT5 code une sirtuine mitochondriale NAD+-dépendante dont la fonction principale est d’agir comme désuccinylase, démylonylase et déglutarylase des lysines, remodelant ainsi le paysage d’acylation des enzymes métaboliques. En régulant des cibles du cycle de l’acide tricarboxylique (cycle de Krebs), de l’oxydation des acides gras, du métabolisme des corps cétoniques et du cycle de l’urée, SIRT5 coordonne l’homéostasie énergétique mitochondriale et l’équilibre rédox dans des conditions d’apport nutritif changeantes. Une activité altérée de SIRT5 a été associée à une dysfonction mitochondriale, à des réponses au stress oxydatif et à une reprogrammation du métabolisme intermédiaire observées dans divers états cellulaires liés aux maladies, notamment en biologie du cancer ainsi que dans des phénotypes cardiométaboliques et associés aux neurodégénérescences. Ces caractéristiques font de SIRT5 un nœud utile pour étudier le contrôle post-traductionnel des voies mitochondriales et le métabolisme adaptatif face au stress.

SIRT5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SIRT5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SIRT5 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SIRT5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SIRT5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SIRT5. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SIRT5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SIRT5 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SIRT5 dans les cellules tumorales présentant une expression de SIRT5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.