SIRT4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401187-ACT

Humanes SIRT4 kodiert ein mitochondriales Sirtuin mit NAD+-abhängiger enzymatischer Aktivität, das die Funktion metabolischer Enzyme durch ADP-Ribosylierung und Deacylierung moduliert und dadurch die Glutaminverwertung, die Fettsäureoxidation und die Insulinsekretion beeinflusst. Durch die Regulation der mitochondrialen Bioenergetik und des anaplerotischen Flusses trägt SIRT4 zur zellulären Anpassung an die Nährstoffverfügbarkeit und an oxidativen Stress bei. Die Aktivität von SIRT4 greift in Signalwege ein, die die mitochondriale Homöostase steuern, darunter die Redox-Balance und metabolische Checkpoint-Signalgebung. Eine fehlregulierte SIRT4-Expression wurde mit der in der Krebsbiologie beobachteten metabolischen Umprogrammierung, mit diabetesassoziierten Phänotypen und mit weiteren Erkrankungen in Verbindung gebracht, die mit mitochondrialer Dysfunktion zusammenhängen.

SIRT4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SIRT4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SIRT4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SIRT4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SIRT4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SIRT4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SIRT4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SIRT4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SIRT4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SIRT4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.