Plasmide CRISPR d'Activation (h) SIRT1: sc-400085-ACT

Le gène humain SIRT1 code une histone désacétylase de classe III dépendante du NAD+ qui module l’accessibilité de la chromatine et les programmes transcriptionnels en désacétylant des substrats histoniques et non histoniques, notamment p53, les facteurs FOXO, NF-κB et PGC-1α. Via ces cibles, SIRT1 intègre la détection de l’état nutritionnel aux réponses au stress, à la biogenèse mitochondriale, à l’autophagie et aux voies de réparation des dommages à l’ADN. L’activité de SIRT1 influence l’homéostasie métabolique, l’inflammation et la sénescence cellulaire, et son dérèglement est ainsi lié à la biologie des maladies cardiométaboliques, à des mécanismes associés à la neurodégénérescence et à une reprogrammation transcriptionnelle pertinente pour les tumeurs. En tant que nœud central épigénétique et de signalisation, SIRT1 est fréquemment étudiée dans des modèles de stress oxydant, de phénotypes liés au vieillissement et d’activation immunitaire.

SIRT1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SIRT1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SIRT1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SIRT1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SIRT1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SIRT1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SIRT1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SIRT1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SIRT1 dans les cellules tumorales présentant une expression de SIRT1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.