SIM1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405931-ACT

Das humane SIM1 (single-minded homolog 1) kodiert einen bHLH-PAS-Transkriptionsfaktor, der die Spezifizierung neuronaler Zelllinien sowie Transkriptionsprogramme reguliert, die für die Entwicklung des Hypothalamus und die neuroendokrine Homöostase erforderlich sind. SIM1 wirkt über die Heterodimerisierung mit Partnern der ARNT-Familie und durch die Integration PAS-Domänen-vermittelter Signale, um Gennetzwerke zu steuern, die an Appetitregulation, autonomem Gleichgewicht und Energieverbrauch beteiligt sind. Eine veränderte SIM1-Dosierung oder Störungen der Regulation werden mit hypothalamischer Dysfunktion und adipositasassoziierten Phänotypen in Verbindung gebracht, was SIM1 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Untersuchung der transkriptionellen Kontrolle metabolischer Signalwege macht. In Zell- und Gewebemodellen bietet SIM1 einen gut handhabbaren Ansatzpunkt, um entwicklungsbezogene Transkriptionsschaltkreise, Enhancer-Logik und nachgeschaltete Neuropeptid-Signalwege zu analysieren.

SIM1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SIM1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SIM1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SIM1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SIM1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SIM1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SIM1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SIM1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SIM1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SIM1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.