Plasmide CRISPR d'Activation (h) SID-2: sc-407959-ACT

Le SIDT2 (SID-2) humain code une protéine membranaire endolysosomale impliquée dans le transport intracellulaire des acides nucléiques et dans des processus homéostatiques associés aux lysosomes. Les fonctions rapportées relient SID-2 au trafic endocytaire, à l’intégrité lysosomale et à des réseaux plus larges de protéostasie qui influencent le renouvellement des macromolécules et les réponses au stress. Par ces voies, SIDT2 a été étudié dans des contextes où la dysfonction lysosomale contribue à des phénotypes cellulaires, notamment dans des modèles pertinents pour les maladies neurodégénératives et métaboliques. La modulation de l’expression de SIDT2 soutient des études mécanistiques du transport endolysosomal, de la gestion de l’ARN et de la signalisation dépendante des lysosomes.

SID-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SIDT2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

SID-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SIDT2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SIDT2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de SID-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SIDT2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de SID-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie SID-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de SIDT2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.