SIAH-2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401503-ACT

SIAH2 kodiert SIAH-2, eine E3-Ubiquitin-Ligase vom RING-Typ, die den Proteinumsatz reguliert, indem sie spezifische Substrate zur Ubiquitinierung und zum proteasomalen Abbau markiert. SIAH-2 integriert Signale aus Hypoxie- und zellulären Stressantworten und moduliert Signalwege, die mit der HIF-Signalgebung, der MAPK-Aktivität und der Zellzykluskontrolle verknüpft sind, und beeinflusst dadurch Transkriptionsprogramme, Stoffwechsel und Überleben. Durch die ubiquitinabhängige Kontrolle von Signalweg-Intermediaten kann SIAH-2 Netzwerke der Zelladhäsion und -motilität umgestalten und zur Remodellierung des Tumormikromilieus beitragen. Eine dysregulierte Expression oder Aktivität von SIAH2 wurde mit veränderter Hypoxieanpassung und Proteostase in Zusammenhängen in Verbindung gebracht, die für die Krebsbiologie und andere stressassoziierte Erkrankungen relevant sind.

SIAH-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SIAH2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SIAH-2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SIAH2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SIAH2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SIAH-2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SIAH2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SIAH-2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SIAH-2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SIAH2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.