SHIP-1 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-421137-ACT

Inpp5d kodiert SHIP-1 (SH2-Domänen-enthaltende Inositol-5-Phosphatase 1), eine in hämatopoetischen Zellen angereicherte Lipidphosphatase, die Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat (PIP3) zu PI(3,4)P2 hydrolysiert und dadurch PI3K-abhängige Signalübertragung abschwächt. Indem SHIP-1 die Anreicherung von PIP3 ausbalanciert, prägt es die nachgeschaltete AKT/mTOR-Aktivität und beeinflusst die Signalweiterleitung von Immunrezeptoren wie Fc-Rezeptoren, Zytokinrezeptoren und Antigenrezeptoren. In Mausmodellen ist die SHIP-1-Aktivität mit der Regulation der Aktivierungsschwellen myeloider und lymphoider Zellen, inflammatorischer Signalwege sowie der homöostatischen Kontrolle von Überleben und Differenzierung von Immunzellen verknüpft. Fehlregulierte INPP5D/SHIP-1-Signalwege sind breit relevant für die Forschung zu Immundysfunktionen und entzündungsassoziierten Phänotypen, einschließlich Kontexte, in denen die PI3K-Signalgebung gestört ist.

SHIP-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Inpp5d-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SHIP-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Inpp5d-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Inpp5d-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SHIP-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Inpp5d-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SHIP-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SHIP-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Inpp5d-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.