Plásmido CRISPR de Activación (h) Shh: sc-400225-ACT

El SHH humano codifica Sonic hedgehog (Shh), un morfógeno secretado que coordina el patrón embrionario, la polaridad tisular y el comportamiento de células madre/progenitoras a través de la cascada de señalización Hedgehog. Shh se une a PTCH1 para aliviar la represión de SMO, lo que permite la activación de los factores de transcripción GLI y de programas posteriores que regulan la proliferación, la diferenciación y la organización espacial. En tejidos adultos, SHH contribuye a las interacciones epitelio–mesénquima y al mantenimiento de nichos, y la desregulación de la señalización Hedgehog está implicada en trastornos del desarrollo y en contextos de señalización oncogénica. La actividad de la vía SHH se estudia con frecuencia por su papel en el desarrollo del tubo neural y de las extremidades, la organogénesis y el control transcripcional dependiente de señales.

Shh El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de SHH sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Shh El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus SHH en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional SHH, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Shh. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo SHH y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Shh en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Shh en células tumorales con expresión de SHH silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.