Sec61α1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402222-ACT

SEC61A1 kodiert die Alpha‑Untereinheit des Sec61-Translokons, eines konservierten proteinleitenden Kanals in der Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER), der die kotranslationale Insertion und Translokation neu entstehender Polypeptide vermittelt. Sec61α1 wirkt an der Schnittstelle von Ribosomen-Andockung, Signalpeptiderkennung und ER-Proteinqualiätskontrolle und verknüpft damit die Biogenese des sekretorischen Weges mit der Proteostase und der „Unfolded Protein Response“ (UPR). Durch die Steuerung des ER-Eintritts sekretierter und membranständiger Proteine beeinflusst SEC61A1 Prozesse wie die Reifung von Glykoproteinen, den ER-assoziierten Abbau (ERAD) und die zelluläre Stresssignalgebung. Eine Störung der ER-Translokationskapazität ist relevant für Erkrankungen, die durch ein Ungleichgewicht der Proteostase und Fehlfunktionen des sekretorischen Weges getrieben sind, was die Untersuchung von SEC61A1 in Kontexten wie Zellüberleben, Differenzierung und Stressanpassung unterstützt.

Sec61α1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SEC61A1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Sec61α1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SEC61A1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SEC61A1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Sec61α1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SEC61A1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Sec61α1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Sec61α1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SEC61A1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.