Plasmide CRISPR d'Activation (h) Sec6: sc-405053-ACT

L’EXOC3 humain code Sec6, une sous-unité essentielle du complexe d’arrimage exocystique qui coordonne le ciblage et l’amarrage des vésicules sécrétoires sur des domaines spécifiques de la membrane plasmique. Sec6 soutient l’exocytose polarisée, le trafic membranaire et la coordination du cytosquelette, influençant des processus tels que la migration cellulaire, la croissance des neurites et la polarité épithéliale. Par son rôle dans l’arrimage des vésicules, la fonction d’EXOC3 s’articule avec des voies régissant le recyclage des récepteurs et la sécrétion régulée, qui façonnent les sorties de signalisation. Une dérégulation du trafic médié par l’exocyste a été associée à une polarité cellulaire altérée et à des phénotypes invasifs, faisant d’EXOC3 un point d’entrée utile pour étudier, dans des modèles pertinents pour la maladie, des mécanismes dépendants de la sécrétion.

Sec6 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de EXOC3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Sec6 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus EXOC3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription EXOC3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Sec6. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus EXOC3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Sec6 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Sec6 dans les cellules tumorales présentant une expression de EXOC3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.