SAS-6 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401644-ACT

Human SASS6 kodiert SAS-6, eine zentrale Komponente des zentriolären Cartwheel-Systems, die für die neunfache Symmetrie während der Zentriolenbiogenese erforderlich ist. SAS-6 koordiniert die Prozentriolenbildung und die Zentriolenduplikation und unterstützt über den Zellzyklus hinweg die Integrität des Zentrosoms, die Organisation der Mikrotubuli sowie den korrekten Aufbau des mitotischen Spindelapparats. Eine gestörte Regulation von SAS-6 wird mit Zentrosomenamplifikation, chromosomaler Instabilität und veränderten Proliferationsprogrammen in Verbindung gebracht, die häufig im Kontext von Krebs und anderen zellzyklusassoziierten Pathologien untersucht werden. Als Zentrosom-/Zentriolenfaktor ist SAS-6 zudem für Modelle von Defekten der Ziliogenese und damit verbundenen Entwicklungsphänotypen relevant, die durch eine beeinträchtigte Basalkörperfunktion verursacht werden.

SAS-6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SASS6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SAS-6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SASS6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SASS6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SAS-6-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SASS6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SAS-6-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SAS-6-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SASS6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.