Plásmido CRISPR de Activación (h) saposin: sc-401394-ACT

PSAP codifica prosaposina, un precursor lisosomal que se procesa proteolíticamente en saposinas A–D, proteínas activadoras esenciales de las hidrolasas de esfingolípidos. Al facilitar el catabolismo de los glicoesfingolípidos y las ceramidas, las saposinas sustentan la función lisosomal, la renovación de lípidos de membrana y la homeostasis endolisosomal, vinculando PSAP con las vías de autofagia-lisosoma y las respuestas celulares al estrés. La alteración del procesamiento de la prosaposina o de la actividad de las saposinas perturba el metabolismo de los esfingolípidos, lo que conduce a fenotipos de almacenamiento lipídico y a patología celular asociada a la neurodegeneración. En consecuencia, PSAP se estudia ampliamente en modelos de enfermedades de depósito lisosomal, mantenimiento de la mielina e inflamación impulsada por señales lipídicas alteradas.

saposin El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de PSAP sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

saposin El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus PSAP en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional PSAP, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de saposin. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo PSAP y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de saposin en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía saposin en células tumorales con expresión de PSAP silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.