SAP 155 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402925-ACT

SF3B1 kodiert SAP 155, eine zentrale Komponente des SF3b-Subkomplexes innerhalb des U2-snRNP, der für die Erkennung des Branchpoints und die präzise Entfernung von Introns während des Prä‑mRNA-Spleißens erforderlich ist. Indem SAP 155 den Zusammenbau und die Stabilisierung des Spleißosoms an der 3′-Spleißstelle unterstützt, beeinflusst es alternative Spleißprogramme, die die Proteomdiversität prägen und die RNA-Prozessierung mit der transkriptionellen Regulation koordinieren. Eine Störung der SF3B1-abhängigen Auswahl von Spleißstellen beeinträchtigt die RNA-Reifung und kann die Expression von Signalwegen verändern, die den Zellzyklus, DNA-Schadensantworten und Differenzierung steuern. SF3B1 wird häufig im Kontext der Spleißosomenbiologie und krankheitsassoziierter Fehl-Spleißvorgänge untersucht, da wiederkehrende kodierende Varianten mit weitreichendem aberrantem Spleißen und einer Umprogrammierung des Transkriptoms in Verbindung gebracht werden.

SAP 155 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SF3B1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

SAP 155 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SF3B1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SF3B1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen SAP 155-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SF3B1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von SAP 155-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des SAP 155-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SF3B1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.