robo4 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401856-ACT

ROBO4 (Roundabout Guidance Receptor 4) kodiert einen in Endothelzellen besonders stark exprimierten transmembranen Rezeptor, der zur Aufrechterhaltung der Gefäßstabilität beiträgt und angiogenes Verhalten reguliert. Robo4 moduliert die Zytoskelettdynamik und die Barrierefunktion des Endothels, indem es Leit- und Adhäsionssignale beeinflusst, einschließlich Crosstalk mit SLIT-Signalen und Signalwegen, die mit VEGF-getriebener Permeabilität verknüpft sind. Über diese Mechanismen ist ROBO4 für Prozesse wie Gefäßaussprossung, vaskuläre Entzündung und Leukozyten-Trafficking in der Mikrovaskulatur breit relevant. Eine dysregulierte ROBO4-Expression oder -Signalgebung wurde mit pathologischer Angiogenese und einer veränderten Gefäßintegrität in Verbindung gebracht, wie sie bei unterschiedlichen kardiovaskulären und tumorassoziierten vaskulären Phänotypen beobachtet wird.

robo4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ROBO4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

robo4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ROBO4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ROBO4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen robo4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ROBO4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von robo4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des robo4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ROBO4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.