Plásmido CRISPR de Activación (h) RNF8: sc-401909-ACT

RNF8 codifica una ligasa E3 de ubiquitina que actúa como un amplificador temprano de la señalización en la respuesta al daño del ADN, catalizando la ubiquitinación en los sitios de roturas de doble hebra para coordinar el reclutamiento de factores de reparación. Mediante interacciones con MDC1 y un acoplamiento dependiente de fosforilación en la cromatina dañada, RNF8 promueve el ensamblaje dependiente de ubiquitina de mediadores posteriores como 53BP1 y BRCA1, influyendo en la elección de la vía entre la unión de extremos no homóloga y la recombinación homóloga. La actividad de RNF8 también vincula la vigilancia del genoma con el control de los puntos de control del ciclo celular y la remodelación de la cromatina, ayudando a mantener la estabilidad genómica bajo estrés replicativo. La señalización desregulada de RNF8 se ha asociado con una capacidad alterada de reparación del ADN y con fenotipos de inestabilidad genómica relevantes para la biología del cáncer y la sensibilidad a agentes genotóxicos.

RNF8 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de RNF8 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

RNF8 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus RNF8 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional RNF8, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de RNF8. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo RNF8 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de RNF8 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía RNF8 en células tumorales con expresión de RNF8 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.