Plasmide CRISPR d'Activation (h) RNF43: sc-403797-ACT

RNF43 code une ligase E3 de type RING qui agit comme régulateur négatif de la signalisation Wnt/β-caténine en favorisant l’ubiquitination et la dégradation des récepteurs Frizzled, limitant ainsi l’abondance des récepteurs Wnt à la membrane plasmique. Par ce rôle, RNF43 contribue au contrôle de l’homéostasie épithéliale, de la signalisation des cellules souches et des programmes de prolifération sensibles à l’intensité de la voie Wnt. Une activité altérée de RNF43 a été associée à une signalisation Wnt dérégulée et à des contextes génomiques liés à la biologie tumorale gastro-intestinale et pancréatique, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude de la dépendance aux voies de signalisation et des boucles de rétrocontrôle. RNF43 est également utilisé comme point d’entrée moléculaire pour explorer la régulation, médiée par l’ubiquitine, du trafic des récepteurs et les interactions entre voies de signalisation.

RNF43 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RNF43 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

RNF43 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RNF43 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RNF43, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de RNF43. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RNF43 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de RNF43 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie RNF43 dans les cellules tumorales présentant une expression de RNF43 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.